蛋白芯片在狼疮性肾炎研究中的应用

RayBiotech抗体芯片在狼疮性肾炎研究中的应用

杂志名称：JCIinsight

影响因子：6

文献题目：Integrated urine proteomics and renal single-cellgenomics identify an IFN-γ response gradient in lupus nephritis

第一作者：Andrea Fava

通讯作者：Andrea Fava

作者单位：

Division of Rheumatology, Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore, Maryland, USA.

本实验所用产品：

GSH-CAA-X00（可同时检测1000个人类细胞因子的半定量玻璃芯片）

实验样品：尿液

研究背景：

狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮（SLE）最严重的表现之一。狼疮性肾炎影响高达50%的患者，导致10%的终末期肾病，与一般人群相比，其死亡率增加了8倍。由于肾炎通常是无症状的，SLE患者需要连续筛查是否存在异常尿蛋白。当蛋白尿升高时，进行肾活检以确认诊断并指导治疗。组织病理学分类根据炎症和纤维化的存在、数量和位置将狼疮肾炎分为6类。例如，肾小球内免疫细胞浸润（III类和IV类）的存在确定了SLE肾炎最具侵袭性的增殖形式，可通过更强的免疫抑制进行治疗。研究表明狼疮性肾炎是一个动态的过程，因此在某一时间点从肾活检推断疾病状态的价值可能有限。最近的单细胞RNA-Seq研究揭示了狼疮肾炎中免疫细胞的复杂网络及其多样性。由于具有相同组织学分类的患者可能会有显著不同的结果，因此需要一种新的基于生物学的狼疮肾炎分类方法来分析异质性。前期研究探索了利用靶向和系统蛋白质组学方法评估和预测狼疮肾炎的潜在生物标志物。然而，这些在临床实践尚未被标准化。

1 结果

1.1 尿蛋白质组学基于免疫激活梯度对狼疮性肾炎患者分类

    这项研究旨在探讨是否可以根据尿液中不同的生物模式对狼疮性肾炎患者进行分类。研究人员对30例SLE的尿液样本进行1000种蛋白质检测。为了确定炎症的模式，研究人员使用了主成分分析（PCA）。如图1所示，前两个主成分（PC）根据尿液蛋白的表达不同将健康者与SLE患者明确分开。在狼疮性肾炎患者中，第一主成分（PC1）按梯度对患者进行分层（图2A）。研究人员注意到，PC1值较高的患者更有可能患有增生性狼疮肾炎，而单纯膜性狼疮肾炎患者的PC1值接近0或为阴性（图2A和B），这表明PC1检测到了许多增生性狼疮肾炎患者共有的生物学反应。接下来，研究人员试图描述PC1梯度的生物学意义。PC1所有蛋白的通路分析显示PC1与趋化通路有关（FDR<0.01）（图2D）。特别是，一种对IFN -γ，IL-1β和TNF反应，直接吸引单核细胞、NK细胞和CD8+T细胞的趋化因子模式。这些发现表明尿液蛋白组学分析证实了狼疮性肾炎患者特异性免疫激活因子的差异表达及更强信号与增生性狼疮肾炎相关。

1.2 尿细胞因子反映髓细胞和细胞毒性淋巴细胞在肾内的产生

研究人员猜测狼疮肾炎患者尿液中的趋化因子是否提示肾内浸润免疫细胞。为了证明这假设，研究人员分析了24例狼疮性肾炎患者肾活检的单细胞转录组（图3A和B）。研究人员对肾细胞中尿液PC1中2条最丰富的途径（“趋化因子介导的信号途径”，GO:0070098；细胞对干扰素-γ的反应”，GO:0071346）中发现的蛋白质编码基因进行了单细胞转录组学分析（图4）。趋化因子评分定义为上述基因正常表达的总和。尽管这些趋化因子在大多数浸润性免疫细胞和上皮细胞中表达，但在髓样细胞、NK细胞和CD8+T细胞中观察到显性表达（图3C-F）。为了评估尿液中发现的蛋白质是否由于肾小球或肾小管损伤而非来源于血清，研究人员校正白蛋白和β2-微球蛋白后重新分析，分析结果几乎与未经调整的分析相同。这些结果表明，尿液蛋白质组学鉴定的趋化因子来源于肾内，尤其是髓样细胞、NK细胞和CD8+T细胞。

1.3 所有狼疮性肾炎患者IFN-γ主要由CD8+和NK细胞浸润产生

通路分析显示IFN-γ、IL-1β或TNF可诱导趋化因子模式。在3种细胞因子中，IFN-γ阳性细胞最多，其次是TNF和IL-1β（图3G）。IFN-γ主要由CD8+T和NK细胞产生；TNF由髓样细胞、CD8+和CD4+T细胞产生；IL-1β几乎完全由髓样细胞产生（图3B和H）。这些细胞因子的局部转录表明它们在肾脏中的转录特征和尿液中的蛋白质水平是肾内产生的直接结果。由于患者对数据库贡献了不同数量的细胞，研究人员评估了这些发现是否有偏差。在所有患者中都发现了IFN-γ+细胞，占总免疫细胞的4%-45%（平均18%）；TNF+细胞占4%-32%（平均16%）；IL-1β+占0%-13%（平均7%）（表2）。相反，研究人员没有发现任何1型IFN（图5）或2型免疫（Th2）细胞因子的转录如IL-4、IL-5或IL-13（图6），表明1型（Th1）免疫应答在狼疮性肾炎患者中普遍存在的，和IFN-γ（2型IFN）是狼疮性肾病免疫细胞产生的主要IFN。

1.4 尿蛋白质组学可预测肾内细胞浸润        

研究人员假设尿液蛋白质组学可以用来推断狼疮性肾炎肾脏浸润细胞类型的组成。研究人员分析了6例患者的尿液蛋白质组学和肾组织单细胞转录组学。其中，4例患者根据组织病理学诊断为增生性狼疮性肾炎（包括混合性），2例为单纯膜性狼疮性肾炎（图7A）。单细胞转录组学显示，不考虑组织病理类型，均存在异质性细胞浸润（图7B）。研究人员发现尿液蛋白质组学PC1值与肾浸润CD8+T细胞的丰度（r2=0.84，P<0.01；图7C）密切相关，而与其他细胞类型无显著相关。这些发现表明尿液蛋白表达模式可以预测狼疮性肾炎患者浸润肾的免疫细胞组成，并且主要分泌IFN-γ的CD8+T细胞可能是尿中免疫激活信号的关键贡献者。