蛋白芯片在狼疮肾炎新型生物标志物开发中的应用

抗体芯片在狼疮肾炎新型生物标志物开发中的应用

杂志名称：Ann Rheum Dis

影响因子：16.102

文献题目：Quantitative planar array screen of 1000proteins uncovers novel urinary protein biomarkers of lupus nephritis

第一作者：Kamala Vanarsa

通讯作者：Chandra Mohan

作者单位：Department of Biomedical Engineering, University of Houston

本实验所用产品：QAH-CAA-X00（定量检测人1000个蛋白抗体芯片）

实验样品：尿液样本

研究背景：

    系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，近年来，大量的研究人员对其生物标记物进行研究。从生物样品中发现生物标志物是一项重要的工作，这些生物标志物无需采取侵入式方法即可获得，并且可以在患有或不患有狼疮性肾炎（LN）的SLE患者之间进行区分。 有效的尿液标志物的发现可能会取代传统肾脏活检的金标准，可以极大地促进以频繁的间隔进行纵向监测，以便密切跟踪疾病的进展并相应地调整治疗方案。

    以前用于生物标记物检测的大多数方法都采用了偏见性的原理，其基础是探索与SLE相关的既定病理生理学途径，例如炎症或生长因子途径。虽然有用，但这些方法限制了新型生物标志物及其相关途径的发现。近年来，几种方法已用于无偏性生物标志物筛选，包括质谱法和飞行时间串联质谱法。这些方法通常被高丰度的蛋白质所淹没，而使用了各种配体（例如抗体）的基于亲和力的方法有可能发现较低丰度的蛋白质。在这项研究中，研究者使用了抗体芯片来筛选和定量1000种蛋白质，以鉴定SLE患者的潜在尿液生物标志物。

1 结果

1.1 高通量抗体芯片筛选尿液差异蛋白

    从24名受试者（HC = 9，活跃SLE = 15）中收集尿液样本，用于筛选1000种不同的人类蛋白质（QAH-CAA-X00,RayBiotech)。302个蛋白质达到p<0.05和FC> 2的显着性阈值（图1A，1B)。

    302种尿液蛋白质进行IPA分析，生成了22个网络，其中8个网络分别包含至少20种尿液蛋白质。这八个升高的尿蛋白网络包括与NFKB激活，p38丝裂原激活的蛋白激酶激活和AKT激活有关的途径（图1C–E）。

    LN尿液中升高的NFKB调节蛋白包括TNF家族的多个成员，包括TNFRSF-11B（OPG），17（BAFF），1A，1B（TNFα）和8（CD30），以及TNFSF-14（LIGHT，HVEML）和18（GITRL），白介素1（IL-1）家族成员，IL-17和几种趋化因子，其中许多与多种自身免疫性疾病有关，包括狼疮。

1.2 差异蛋白选择

    使用更严格的标准来确定应该选择哪种尿蛋白，以便进行进一步验证。如图2A所示，FC> 5时，SLE尿液中有64种蛋白质升高，p <0.05，SLE尿液中的标志物浓度超过2000 pg / mg。其中，经过多次测试校正后，有54种蛋白质的q <0.05。为了生成更具选择性的候选生物标记集，仅考虑FC> 15的蛋白进行进一步验证，从而将要验证的候选列表减少到34个。随机森林分析（RFA）也用于选择最能区分HC和SLE样品的尿蛋白（图2B）。

    除去一些目前已经有人研究的蛋白，尿液中丰度过低以及有强线性相关性的蛋白，最终保留9种（Angptl4, FOLR2, GPC-5, L-selectin, PDGF-Rβ, PRX2, TGFβ−1, TPP-1 and TSP-1）尿蛋白进行进一步验证。

1.3 差异蛋白验证

    ELISA验证使用了一个独立的队列，78名受试者（HC = 16，SLE = 17，ANR = 16，AR = 29）（图3）。

 ELISA结果显示，与HC相比，AR患者尿Angptl4，FOLR2，GPC-5，L-selectin，PDGF-Rβ，PRX2和TSP-1均显着上调。此外，与ANR、SLE相比，AR患者尿Angptl4，FOLR2，L-selectin，TGFβ1，TPP1和TSP-1均显着升高，表明这些尿蛋白均指示活动性SLE患者的肾性狼疮。在图4中ROC进一步突出了这些尿蛋白在区分ANR和AR SLE或AR和非活性SLE之间的性能。如图4A所示，这些尿蛋白在区分AR与ANR SLE方面均优于传统的临床参数，例如抗dsDNA（AUC = 0.58），C3（AUC = 0.48）和C4（AUC =0.34）。接下来，使用lasso回归分析，将多种蛋白质合并为一组，以评估尿液蛋白质的任何特定组合是否显示出进一步的诊断潜力。如图4B所示，在将AR与ANR SLE区分时，尿液L-selectin，Angptl4和TPP1的组合表现出最佳的诊断潜力，AUC为0.97。

接下来进行多元回归分析，以评估测定的尿蛋白预测各种临床指标的程度。如图5A所示，基于线性回归分析，大多数测定的尿蛋白显示出与rSLEDAI，尿蛋白和/或PGA的显着关联。

1.4 候选尿液生物标志物在追踪LN患者疾病活动中的表现

为研究候选尿液生物标志物在追踪LN患者疾病活动中的表现，对7例多次就诊的LN患者进行了尿Angptl4，L-selectin，TGFβ1和TPP1的检测。图6中的序列追踪图显示了这些蛋白质以及SLEDAI，rSLEDAI和uPCR随时间的波动。这些蛋白同时升高（标记为“ @”），并随疾病活动的增加而升高（如SLEDAI或rSLEDAI指数或uPCR所反映）；而这些蛋白先于临床耀斑出现（标记为“ p”）。如图6所示。在所有7名患者中，尿液L-selectin在SLEDAI或rSLEDAI恶化之前或同时发生，在图6中用“ @”和“ p”符号标记。尿Angptl4在7例患者中有6例表现良好，在SLEDAI或rSLEDAI恶化之前或与此同时。尿液中的TGFβ1在7例患者中有5例在SLEDAI或rSLEDAI恶化之前或同时发生（图6），排名第三。在所有情况下，尿液生物标志物的波动远比尿蛋白的细微变化更为明显。在某些情况下，尿液生物标志物甚至在尿蛋白上升之前就显示出升高的迹象，并且与尿蛋白相比，其对疾病活动的追踪更好。

连续数据的统计分析证实，当连续跟踪LN疾病活动时，尿液L-selectin是疾病活动的最佳预测指标，其次是Angptl4和TGFβ1。

1.5 LN肾脏内尿液候选生物标志物的表达

为了进一步探索LN肾脏内细胞水平上候选生物标志物的潜在来源，肾脏scRNA-seq获得了21例LN活检数据（图8A），并从24个独立的LN活检中的肾浸润免疫细胞获得了scRNA-seq数据（图8B）。这些蛋白质在LN肾脏中的表达谱强烈支持了LN尿液中升高的蛋白质可能起源于肾脏的假说。

结论：

高通量蛋白检测技术从出现改变了生物标记物发现研究的格局。质谱已用于最近的SLE研究中。但是，可能由于高丰度蛋白质（白蛋白，尿素，免疫球蛋白等）的信号遮盖而无法检测到低丰度蛋白质。相反，靶向蛋白质组学测定法（例如本研究中使用的抗体芯片）依赖于配体-蛋白质相互作用，从而有可能准确地检测和定量低丰度蛋白质。研究者使用该平台对LN尿液进行的筛选重新发现了几种已知在SLE或LN中上调的蛋白质，包括Adiponectin, Angiostatin,CD36, Ferritin,Galectin7, ICAM-1,IGFBP家族蛋白,MIF, Resistin, S100A8, Siglec-5和VCAM-1，因此可以独立验证该方法学。在本研究中，并未采用这些标志物，因为大多数标志物已在文献中得到验证。取而代之的是，研究者专注于以前不涉及LN的新型蛋白质，并发现Angptl4，L-selectin和TGFβ1作为潜在的生物标志物，可用于追踪LN中的疾病活动。